NADH檢測試劑盒應該如何正確使用

上海信帆生物供應NADH檢測試劑盒，產品現貨供應！

產品簡介：
? NAD+/NADH檢測試劑盒(WST-8法) (NAD+/NADH Assay Kit with WST-8)是一種基于WST-8的顯色反應，通過比色
法來檢測細胞、組織或其它樣品中NAD+ (氧化型輔酶I)和NADH (還原型輔酶I)各自的量、比值和總量的檢測試劑盒。
? NAD+/NADH以及NADP+/NADPH的傳統檢測方法是檢測NADH或者NADPH在340nm處吸收波長的變化，該方法靈敏度較
低并易受樣品中有類似紫外吸收物質的干擾，并且在紫外檢測過程中通常需要加大檢測樣品量以彌補NADH在340nm處吸
光度過小的不足，因此該傳統檢測方法具有很大的局限性。
? WST-8是MTT的一種升級替代產品，和MTT或其它MTT類似產品如XTT、MTS等相比有明顯的優(yōu)點。首先，MTT被一些脫
氫酶還原生成的formazan不是水溶性的，需要有特定的溶液來溶解；而WST-8和XTT、MTS產生的formazan都是水溶性的，
可以省去后續(xù)的溶解步驟。其次，WST-8產生的formazan比XTT和MTS產生的formazan更易溶解。再次，WST-8比XTT和
MTS更加穩(wěn)定，使實驗結果更加穩(wěn)定。另外，WST-8和MTT、XTT等相比，線性范圍更寬，靈敏度更高。
? WST-8 和WST-1 相比，檢測靈敏度更高，更易溶解，并且更加穩(wěn)定。
? 本試劑盒使用便捷，無需分離純化細胞、組織或其它樣品中的NAD+和NADH，并且能特異性檢測NAD+和NADH，而不檢
測NADP+和NADPH。本試劑盒可以檢測含量低至0.25μM (5pmol)的NAD+或NADH，在0.25μM (5pmol)至10μM (200pmol)之
間呈現良好的線性關系。
? NAD (Nicotinamide adenine dinucleotide，煙酰胺腺嘌呤二核苷酸)是所有細胞中都存在的一種輔酶，包括NAD+ (氧化型)和
NADH (還原型)兩種形式。NAD+既是氧化還原反應過程中傳遞電子的輔酶，又可以作為很多酶的底物來參與細胞內反應。
例如Sirtuins家族的Sirt1等去乙?；妇托枰訬AD+作為底物進行去乙?；磻獊碚{控蛋白的乙酰化水平從而參與細胞的
生命活動過程。NAD+在細胞和體內發(fā)揮著重要的功能，其合成和降解及其產物參與細胞凋亡、代謝調控和基因表達的調
控等，并且NAD+的減少是細胞死亡的主要因素之一。雖然NMNAT (nicotinamide mononucleotide adenylyltransferase)是
NAD+的合成酶，包括Nmnat1、Nmnat2和Nmnat3，但NAMPT (Nicotinamide phosphoribosyltransferase)通常被認為是NAD+合
成的限速酶。NAD+在調節(jié)細胞氧化還原狀態(tài)方面的重要性以及調控信號通路及轉錄方面的功能，使得NAD+及其合成和消
耗的酶成為多種疾病的潛在藥物靶點。

包裝清單：
產品編號 產品名稱  包裝
0175-1    乙醇脫氫酶 220μl
0175-2     顯色液 1.1ml
0175-3     NADH 5mg
0175-4    NADH配制液 0.8ml
0175-5    NAD+/NADH提取液 60ml
0175-6    反應緩沖液 10ml
— 說明書 1份
保存條件：
-20ºC保存，一年有效。顯色液(0175-2)和NADH (0175-3)須-20ºC避光保存。NADH配制成溶液后，須適當分裝后-80ºC保
存。所有試劑避免反復凍融。
注意事項：
? 本試劑盒中的所有試劑均需要冷凍保存，請嚴格按照保存條件進行保存。如果不是一次用完，為避免反復凍融導致產品失
效，請適當分裝后保存。
? NADH不太穩(wěn)定，取出NADH后請盡快使用。如果發(fā)現標準曲線不理想，很有可能是標準品發(fā)生了降解。
? 由于NAD+/NADH提取液比較粘稠，以該提取液作為稀釋液時，無論對標準品還是樣品進行稀釋，在稀釋過程中務必保證
稀釋均勻，否則易造成實驗數據產生較大波動。
? 在樣品加樣和混勻過程中，須盡量避免產生氣泡，以免影響終的吸光度測定。
? 如果不能非常嚴格地控制反應溫度和反應時間，每次檢測都需要設置標準曲線。
? 如果樣品溶液中NAD+和NADH濃度過高或過低，不在試劑盒的線性檢測范圍內時，可適當調整樣品或者提取液的用量。
? 由于NAD+和NADH很不穩(wěn)定，在凍存過程中較易降解，所以宜盡量使用新鮮樣品進行檢測。
? 本產品僅限于專業(yè)人員的科學研究用，不得用于研究診斷或治療，不得用于食品或藥品，不得存放于普通住宅內。
? 為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。
使用說明：
1. 樣品的準備：
a. 細胞樣品的準備：對于貼壁細胞，約1×106個細胞(大約相當于6孔板一個孔長滿的細胞數量)，吸凈培養(yǎng)液，用移液器加
入200μl的NAD+/NADH提取液，并輕輕吹打，以促進細胞的裂解；對于懸浮細胞，約1×106個細胞，600g離心5分鐘，吸
凈培養(yǎng)液，用移液器加入200μl冰浴預冷的NAD+/NADH提取液，并輕輕吹打，以促進細胞的裂解；裂解過程在室溫或
冰上操作均可。隨后12,000g，4ºC離心5-10分鐘，取上清作為待測樣品備用。
b. 組織樣品的準備：冰上預冷的PBS洗滌組織后，稱取約10-30mg的組織樣品，用剪刀剪碎，置于勻漿器中，加入400μl的
NAD+/NADH提取液在室溫或冰上進行勻漿。隨后12,000g，4ºC離心5-10分鐘，取上清作為待測樣品備用。
2. 試劑盒的準備工作：
a. NADH標準品的配制：吸取655μl NADH配制液，充分溶解本試劑盒提供的5mg NADH后即得到10mM NADH標準品。
10mM NADH標準品請適當分裝后-80ºC避光保存。
b. NADH標準曲線的設置：將10mM的NADH標準品用NAD+/NADH提取液稀釋成適當的濃度梯度，如初次檢測可以設置
0、0.25、0.5、1、2、4、6、8、10μM這幾個濃度，檢測時96孔板中每孔加入20μl的標準品，相當于每孔為0、5、10、
20、40、80、120、160、200pmol的NADH。如有必要，在后續(xù)的實驗中可以根據樣品中的NADH含量對標準品的濃度
范圍進行適當調整。其中濃度為0μM的點為空白對照點，僅含NAD+/NADH提取液。注意：由于NADH很不穩(wěn)定，故配
制后需盡快使用。
c. 乙醇脫氫酶工作液的配制：將乙醇脫氫酶用反應緩沖液稀釋45倍，例如2μl乙醇脫氫酶加入到88μl的反應緩沖液中，即
可獲得90μl的乙醇脫氫酶工作液。每個標準品或樣品的檢測需要使用90μl的乙醇脫氫酶工作液，請根據所需檢測的標準
品和樣品的數量，配制適量的乙醇脫氫酶工作液，并注意現配現用。
3. 樣品測定：
a. 樣品中NAD+和NADH的總量的測定：吸取20μl待測樣品至96孔板中，為了減少實驗誤差建議設置樣品的重復孔。后續(xù)
如果發(fā)現樣品中的NAD+和NADH的總量過高，超出標準曲線的范圍，則需要用NAD+/NADH提取液將樣品適當稀釋后
再進行檢測；總量過低時則需要加大細胞或組織樣品的用量。
b. 樣品中NAD+、NADH 的含量或者NAD+/NADH比值的測定：吸取50-100μl待測樣品于離心管中，60ºC水浴或PCR儀上加
熱30分鐘以分解NAD+。如果加熱后產生不溶物，則需10,000g，室溫或4ºC離心5分鐘，吸取20μl上清液作為待測樣品至
96孔板中，為了減少實驗誤差建議設置樣品的重復孔。后續(xù)如果發(fā)現樣品中的NAD+或NADH的含量過高，超出標準曲
線的范圍，則需要用NAD+/NADH提取液將樣品適當稀釋后再進行檢測；含量過低時則需要加大細胞或組織樣品的用量。
c. 請參考下表使用96孔板設置空白對照孔、標準品孔和樣品孔。加入乙醇脫氫酶工作液后充分混勻。

e. 如果希望更加精確地來表述NAD+和NADH總量或各自的含量，可以將樣品用BCA法測定蛋白濃度。終用單位蛋白量中NAD+和NADH總量或各自的含量來比較精確地進行表述。 

NADH檢測試劑盒應該如何正確使用