Western免疫印跡(WesternBlot)是將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到膜上,然后利用抗體進(jìn)行檢測。對已知表達(dá)蛋白,可用相應(yīng)抗體作為一抗進(jìn)行檢測,對新基因的表達(dá)產(chǎn)物,可通過融合部分的抗體檢測。
一:WB實驗代測原理:
1、
WB實驗代測采用的是聚丙烯酰胺凝膠電泳,被檢測物是蛋白質(zhì),“探針”是抗體,“顯色”用標(biāo)記的二抗。經(jīng)過PAGE(聚丙烯酰胺凝膠電泳)分離的蛋白質(zhì)樣品,轉(zhuǎn)移到固相載體(例如硝酸纖維素薄膜)上,固相載體以非共價鍵形式吸附蛋白質(zhì),且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學(xué)活性不變。
2、以固相載體上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原,與對應(yīng)的抗體起免疫反應(yīng),再與酶或同位素標(biāo)記的第二抗體起反應(yīng),經(jīng)過底物顯色或放射自顯影以檢測電泳分離的特異性目的基因表達(dá)的蛋白成分。該技術(shù)也廣泛應(yīng)用于檢測蛋白水平的表達(dá)。
以上是小編為大家講解的原理,那么小編接下來進(jìn)一步講解基本過程有哪些?
二:WB實驗代測基本過程:
1、獲取細(xì)胞或組織裂解物。
2、根據(jù)檢測蛋白的位置選擇合適的裂解buffer。
3、選擇合適的蛋白酶抑制劑,避免蛋白降解,從而保證檢測的準(zhǔn)確性。
4、蛋白定量。
5、電泳分離蛋白質(zhì)。
6、轉(zhuǎn)膜:根據(jù)不同的檢測目的和待測蛋白的特性,選擇合適的膜類型。
7、封閉:去掉膜上多余的非特異性結(jié)合位點,降低背景。
2、一抗孵育。
以上就是小編為大家介紹的全部內(nèi)容,希望對大家有所幫助。